養(yǎng)細(xì)胞看似簡(jiǎn)單，然而卻常常因?yàn)楦鞣N原因，讓我們珍貴的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞一再受損或者死亡，今天為大家講述細(xì)胞從復(fù)蘇、傳代到凍存等一系列過(guò)程及常遇到的那些你可能忽略的小卻重要的細(xì)節(jié)。

細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源

針對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以加1%雙抗！

不同細(xì)胞的培養(yǎng)基是不同的。一般ATCC購(gòu)買的細(xì)胞，針對(duì)不同細(xì)胞株，會(huì)有詳細(xì)介紹，包括生長(zhǎng)的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。培養(yǎng)基一般都是偏紅色，因?yàn)榕囵B(yǎng)基加了酚紅來(lái)顯示顏色，指示pH范圍為6-8，顏色會(huì)由黃變?yōu)樽霞t。這是為了我們能更直觀觀察培養(yǎng)液的變化，如變黃，則代表偏酸，偏堿性了就顯示偏紫色。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)后，變黃后就暗示我們要換培養(yǎng)基啦！若是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或者實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需求，是可以增加血清比例的，一般10%-20%的血清比例是比較OK的，也不建議太高的血清比例。

細(xì)胞的居住環(huán)境

舒適無(wú)菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞居住在培養(yǎng)細(xì)胞的器皿，包括形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板中。最終住進(jìn)37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱。

根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的目的和用途，可以選擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿，如后期要進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，一般使用 6 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，如果濕要進(jìn)行爬片處理，建議使用 24 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力的話，一般用 96 孔板來(lái)種植細(xì)胞等，如果后期實(shí)驗(yàn)需求細(xì)胞量大，可以使用大的培養(yǎng)瓶，甚至細(xì)胞培養(yǎng)工廠來(lái)進(jìn)行。就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿沒(méi)有太大區(qū)別，主要在于安全系數(shù)(培養(yǎng)瓶>培養(yǎng)皿)、培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量(大培養(yǎng)瓶>培養(yǎng)皿)。但是培養(yǎng)瓶成本也會(huì)相對(duì)較高，因此無(wú)特殊要求，一般選擇培養(yǎng)皿即可。

細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存(原則是慢凍速融)

細(xì)胞復(fù)蘇：指將凍存的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過(guò)程。

復(fù)蘇過(guò)程如下圖所示：

有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞復(fù)蘇后，難以貼壁的情況，這個(gè)時(shí)候主要考慮細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)差或者復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時(shí)搖動(dòng)冷凍管，使之盡快通過(guò)最易受損的溫度段(-5～0℃)。還有一種情況就是細(xì)胞貼壁了，卻長(zhǎng)不起來(lái)，這是因?yàn)橐恍┘?xì)胞傾向于維持一定的密度，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)瓶或皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存: 將細(xì)胞放在低溫環(huán)境(-70℃~-196℃)，細(xì)胞內(nèi)的代謝降低，可最大限度的保存細(xì)胞活力，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。大部分實(shí)驗(yàn)室用細(xì)胞凍存盒來(lái)進(jìn)行細(xì)胞凍存，如果沒(méi)有細(xì)胞凍存盒，可先將凍存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或過(guò)夜，最后放入液氮罐內(nèi)。為了節(jié)約時(shí)間，還可直接在凍存盒外包裹一團(tuán)棉花，用棉花代替凍存盒緩慢降溫的特點(diǎn)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過(guò)夜，再轉(zhuǎn)移至液氮保存。為了保證細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞數(shù)量，一般在凍存細(xì)胞時(shí)每管細(xì)胞的濃度應(yīng)在10⁶—10⁷個(gè)/ml/管。

細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

細(xì)胞傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細(xì)胞接觸過(guò)密，生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，影響細(xì)胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細(xì)胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶里。

Q：為什么我們總說(shuō)選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞傳代?

A：細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對(duì)數(shù)期(指數(shù)期)，平穩(wěn)期(平臺(tái)期)和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)期。

Q：那如何確定細(xì)胞對(duì)數(shù)期?

A：根據(jù)上述細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，為了確保活力，必須使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)期就傳代，所以一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿融合時(shí)才去消化傳代。一般細(xì)胞長(zhǎng)到 70% -80%左右即可傳代。

Q：一般細(xì)胞傳代都是1分2嗎?

A：要根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排而定，沒(méi)有固定的必須1分幾，常規(guī)1分2至1分5都可以。此時(shí)我們就要多觀察摸索最合適的傳代比例。

Q：消化很關(guān)鍵嗎?

A：不得不說(shuō)，細(xì)胞狀態(tài)差，很多時(shí)候與傳代時(shí)胰酶消化密切相關(guān)。一般腫瘤細(xì)胞消化1-2min即可。但是每一種細(xì)胞貼壁能力不同，因此對(duì)胰酶的反應(yīng)也不同，我們需要密切跟蹤。一般肉眼觀察到貼壁細(xì)胞層能移動(dòng)即可終止;而非細(xì)胞全部分散成單個(gè)。

Q：部分比較難消化的細(xì)胞怎么辦?

A：可放于37℃培養(yǎng)箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受細(xì)胞為例，放于37℃培養(yǎng)箱消化5-8min，輕輕拍打，才見細(xì)胞成片移動(dòng)，因此針對(duì)難消化細(xì)胞一定要在顯微鏡下密切觀察。

Q：幾天換培養(yǎng)基?

A：正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說(shuō)明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會(huì)脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)1～2天換一次，生長(zhǎng)緩慢時(shí)，3～4天亦可。針對(duì)復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液。

Q：每天觀察細(xì)胞有必要嗎?

A：一般的腫瘤細(xì)胞我們是隔天傳代，但是切不可忽略對(duì)細(xì)胞的觀察，一定要每天都要去看一下細(xì)胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。記住，是每天。

Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來(lái)的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。后續(xù)再密切觀察。

Q：細(xì)胞污染怎么辦?

A：如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染，一般建議丟棄。如果細(xì)胞非常寶貴，可試著加入含抗生素的培養(yǎng)基反復(fù)清洗，并用抗生素含量高的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基;